دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده علوم پايه
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته زيست فناوري
گرايش ميکروبي
عنوان
تهيه کونژوگه پلي ساکاريد PRP هموفيلوس آنفلوآنزا تيپ b با اگزوتوکسين A سودوموناس آئروژينوزا و سنجش ايمني زايي آن در مدل حيواني
استاد راهنما
دکتر حجت احمدي
استاد مشاور
دکتر مهدي نجاتي
نگارنده
محمد ابراهيمي
شهريور 1393
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده فارسي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..15
مقدمه
هموفيلوس آنفولانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….17
ميکروبيولوژي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………19
دسته‌بندي سويه هاي هموفيلوس آنفلوآنزا قابل تيپ بندي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20
کلون سازي و تهاجم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..22
1-2-4 کلون‌سازي در مجراي تنفسي فوقاني…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………22
1-3-4 حمله به اپيتليوم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..23
1-4-4 حمله به جريان خون…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………24
1-5-4 بقا در جريان خون…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..25
1-6-4 حمله به CNS……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….26
1-1-5 شاخص‌هاي بيماري زايي هموفيلوس آنفولانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….27
1-2-5 OMPs…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..28
1-3-5- پيلي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………28
1-4-5- ايمونوگلوبولين A1 پروتئاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………30
1-5-5- ليپوپلي ساکاريد (LPS) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..31
1-6-5- نقش LPS در بيماري‌زايي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………32
1-1-6 کپسول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….34
1-2-6- دخالت کپسول در بيماري‌زايي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….36
1-3-6- ژنتيک بيان کپسول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………36
1-1-8 روشها و آزمونهاي تشخيص آزمايشگاهي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
1-2-8 روشهاي تشخيص کلاسيک…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38
1-3-8- معايب تشخيص کلاسيک………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….39
1-4-8- برتري روشهاي تشخيص مولکولي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………40
1-1-9- اپيدميولوژي …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….40
1-1-10- پيشگيري …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………44
1-1-11- درمان……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45
2-1 واکسن هاي کونژوگه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48
2-2- واکسن‌هاي Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..49
2-3- پاسخ هاي واکسن کونژوگه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..50
2-4- پاسخ هاي واکسن پلي‌ساکاريدي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..51
2-5- عوامل دخيل در ايمونوژنسيتي واکسن هاي کونژوگه پلي ساکاريدي – پروتئيني……………………………………………………………………………………….51
2-5-1- طول زنجيره پلي ساکاريدي …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..51
2-5-2- نوع اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………52
2-5-3- مولکول هاي حامل ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………52
2-6-EDC يا EDAC………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………52
2-7- کونژوگاسيون به روش آميداسيون ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………53
2-8- تهيه کونژوگه ايمونوژن هاپتن1 – حامل……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
2-9- پروتئين هاي حامل مناسب براي ايجاد کونژوگه هاي آنتي ژنيک…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55
2-10- ادجوانت هاي مناسب در طراحي واکسن کونژوگه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
2-11- سنجش فعاليت باكتري كشي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..56
فصل سوم- مواد و روش ها
3-1-1 مواد و وسايل لازم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60
3-2-1- تهيه ميكروارگانيسم هاي به كار گرفته شده در اين مطالعه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….66
3-2-2-باز كردن سويه باکتري همو فيلوس آنفولانزاي تيپ b ليوفيليزه و کشت آن…………………………………………………………………………………………………66
3-2-3-فرآوردن و تخليص PRP……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….66
3-2-4- تهيه بذر محيط کشت …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..66
3-2-5-تيمار عصاره مخمر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………67
3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقيح بذر ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70
3-2-7-نمونه گيري از فرمانتور…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72
3-2-8- مرحله رسوب دهي الکلي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..73
3-2-9- مرحله الکل زني ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….73
3-2-10- مرحله شست و شو با کلريدمنيزيم……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74
3-2-11- تيمار با ستاولن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………74
3-2-12- افزودن فسفات سديم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………75
3-2-13- مرحله الکل زني مجدد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..75
3-2-14- تيمار با هيدروکسيل آپاتيت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….75
3-2-15- فيلتراسيون سوپرناتانت ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..76
3-2-16- ليوفليزاسيون ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..76
3-2-17- تعيين خلوص PRP تخليص شده ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….76
3-2-18- تست ريبوز …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………76
3-2-18- 1- اساس تست بيال ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….77
3-2-18- 2- معرف‌هاي تست بيال …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….77
3-2-18- 3-محلولها و ترکيبات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………77
3-2-18- 4-تهيه‌ي محلول‌هاي استاندارد ريبوز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..77
3-2-18- 5- آماده سازي PRP تخليص شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….79
3-3-1- آزمون هاي پروتئين سنجي ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79
3-3-2روش برادفورد ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………81
3-3-3- روش پروتئين سنجي Lowry …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..81
3-4-1- آزمون ايمونو ژل ديفيوژن ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….83
3-5- سنجش نوکلئيک اسيد ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………83
3-6-تخليص اگزوتوسين A سودوموناس آئروژينوزا PA103 …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84
3-6-1- طرز باز كردن سوش ليوفيليزه جديد …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84
3-6-2-تهيه لوله بذر ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..84
3-6-3- اطمينان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………85
3-6-4- تست سوش براي توليد اگزوتوکسين A ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….85
3-6-5-تهيه محيط کشت ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………85
3-6-7- رسوب با استات روي 1 مولار ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..87
3-6-8- رسوب با سولفات آمونيوم ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..87
3-6-9- دياليز اگزوتوكسين A …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..88
3-6-10- کروماتوگرافي فيلتراسيون ژل اگزوتوكسين A ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89
3-16-2-1مواد مورد نياز: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….89
3-6-11سنجش توليد اگزوتوكسين A ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….89
3-6-11-1-سنجش توکسيسيتي …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………90
3-6-12- دتوكسيفاي كردن اگزوتوكسين A به روش فرمآلديئد …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..91
3-7- ژل فيلتراسيون جهت تخليص كونژوگه PRP هموفيلوس آنفولانزاي تيپb (Hib) با اگزو توکسين A سودوموناس آئروژينوزا …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3-8- آزمون هاي کنترل و کيفي کونژوگه ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3-9- سنجش پروتئين …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3-11- تعيين ميزان اسيد نوکلئيک …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93
3-12- كنترل توكسيسيته غيرعادي((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94
3-13- آزمون پيروژني ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94
3-14- ايميونيزاسيون خرگوشها و خونگيري …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94
3-15تهيه بافر باربيتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94
3-16- تهيه محلول کوماسي بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94
3-16- پلي آكريل آميد ژل الكتروفورز درحضور سديم دو دسيل سولفات(SDS-PAGE) ………………………………………………………..96
3-16-1- اصول روش SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96
3-16-3- محلولهاي مورد نياز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97
3-16-4- تهيه ژل پايين SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97
3-16-5- تهيه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98
3-16-6-رنگ آميزي ژل پلي آكريل آميد ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99
3-16-7- محلولهاي مورد نياز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100
3-16-8- روش رنگ آميزي …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101
3-17- آزمون بررسي فعاليت باکتريسيدالي سرم حيوان ايميون (SBA1) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101
3-17-1- اصول آزمون SBA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101
3-17-2- مواد مورد نياز براي آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101
3-17-3-روش انجام آزمون ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102
فصل چهارم: نتايج
4-1-کشت سويه باکتري……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107
4-2- شرايط کشت در فرمانتور……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108
4-3- تعيين خلوص PRP ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..109
4-4- اندازه‌گيري ميزان ريبوز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….111
4-5- کنترل ميزان پروتئين در پلي ساکاريد PRP و ETA و PRP- ETA……………………………………………………………………………………………………………..113
4-6- کنترل ميزان اسيد نوکلئيک در پلي ساکاريد PRP و PRP- ETA………………………………………………………………………………………………………………………..113
4-7- کونژوگاسيون PRP با اگزوتوکسينA سودوموناس آئروژينوزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………114
4-8- بازده کونژوگاسيون PRP-ETA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115
4-9- کنترل پيروژني …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..115
4-10- کنترل توکسيسيتي غير عادي در موش سوري……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116
4-11- آزمون ايمونوژل ديفيوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………116
4-12- الکتروفورز (SDS-PAGE) براي بررسي وزن مولکولي …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117
4-13- ارزيابي فعاليت باکتري كشي سرم حيوان واکسينه شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري
5-1- واکسن‌هاي کونژوگه‌ي (Hboc) PRP-CRM197………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….124
5-2- واکسن کونژوگه‌ي PRP-TT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125
5-3- واکسن کونژوگه‌ي PRP-OMP ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125
5-4- توليد کپسول هموفيلوس آنفولانزاي تيپ b(PRP) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126
5-5- کونژوگاسيون PRP با اگزوتوکسين A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127
5-6- سرم باکتريسيدال اسي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….128
نتيجه گيري…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….129
پيشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………129
منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130
.
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1 کلوني هموفيلوس آنفلوانزا در محيط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19
شکل1-2 هموفيلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20
شکل1-3 تيپ هاي مختلف کپسول هموفيلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35
شکل 1-4 پراکندگي سني عفونت Hib از اکتبر 1990 تا سپتامبر 1991 در شش منطقه در انگلستان و والس. از 433 مورد گزارش شده (84%) 362 مورد به علت hib ، (13%) 54 مورد به علت غير سروتيپي و 13 مورد سروتيپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….41
شکال3-1- باز کردن سويه PTCC هموفيلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67
شکال3-2- تيمار عصاره مخمر . چپ: تغيير رنگ آب در روز اول دياليز عصاره مخمر.راست: روز سوم دياليز عصاره مخمر بدون تغيير رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70
شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71
شکال3-4 راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محيط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72
شکال3-5رسوب حاصل از الکل زني……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74
شکل3-6 تهيه استانداردهاي ريبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….78
شکل 3-7 رسوب با سولفات آمونيوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88
شکل 3-8 دياليز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89
شکل 4-1کلوني هموفيلوس آنفلانزا روي محيط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107
شکل 4-2 تست آکروفلاوين…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107
شکل 4-3 طيف سنجي NMR ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110
شکل 4-4 منحني FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111
شکل 5-5 آزمون ايمونوژل ديفيوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116
شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) براي PRP-ETA و ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117
فهرست جدول ها و نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1نمودار استاندارد لوري…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83
جدول 4-1 شاخص هاي فرمانتاسيون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108
نمودار 4-1 تغييرات جذب نوري براي رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار 4-2 تغييرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار 4-3 تغييرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110
جدول 4-2 تهيه استاندارد براي غلظت ريبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112
نمودار 4-4- منحني استاندارد ريبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112
جدول 5-3- ميزان ريبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….112
نمودار 5-5- منحني استاندارد پروتئين……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113
جدول 4-4- ميزان پروتئين……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113
جدول 5-4- ميزان اسيد نوکلئيک………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..114
نمودار 4-6-منحني OD فرکشن هاي کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115
جدول 4-5- عيـار آنتي بادي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….118
جدول 4-6- تيتر آنتي بادي باكتري كشي واكسن کونژوگه (PRP-ETA) و PRP در روزهاي 15،30، 45…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………………………………………………………………….119
چكيده
هموفيلوس آنفلوانزا سروتيپ b مهمترين عامل مننژيت و پنوموني در کودکان زير 5 سال در سراسر جهان مي باشد که پس از کلونيزه شدن در حلق وارد خون شده و باکتريمي مي دهد،در ادامه باکتري از طريق خون خود را به مننژ رسانده و مننژيت مي دهد که عامل 95% باکتريمي و مننژيت ها هموفيلوس آنفلوانزا تيپ b مي باشد که از کپسول پلي ساکاريدي آن موسوم به پلي ريبوزيل ريبيتول فسفات (PRP) جهت توليد واکسن هاي کونژوگه گليکوپروتئيني عليه هموفيلوس آنفلوانزا تيپ b استفاده شده است.به دليل اينکه پاسخ ايمني نسبت به اين پلي ساکاريد غير وابسته به سلول T بوده و در پاسخ ايمني سلول خاطره ايجاد نمي گردد،لذا دوز يادآور تاثيري در بالا بردن سطح ايمني ندارد.براي از بين بردن خاصيت T-INDEPENDT،PRP به طور کوالانسي به اگزوتوکسين A سودوموناس آئروژينوزا (ETA) متصل مي گردد.در اين پروژه سويه استانانداردهموفيلوس آنفلونزا سروتيپ b ابتدا در فرمانتور حاوي محيط CY (کازآمينواسيد – عصاره مخمر )کشت گرديد و تخليص PRP از مايع کشت با انجام روش هاي الکل پرسپيتاسيون (رسوب دادن الکلي) و رسوب دادن با ستاولن (هگزادسيل تري متيل آمونيوم برومايد)،التراساتريفيوژ و تخليص با هيدروکسي آپاتيت حاصل گرديد.جهت تهيه اگزوتوکسين A نيز سويه PA103 سودوموناس آئروژينوزا در محيط کشت تريپتيکازسوي براث کشت گرديد و پس از سنجش توکسيسيته در موش با استفاده از روش قليايي ،سم زدايي شده و جهت کونژوگه نمودن با PRP از ADHو سيانوژن برومايد به عنوان اسپيسر و EDAC به عنوان عامل لينکر استفاده گرديد و کونژوگه حاصل با عبور از ستون CL-4B تخليص شد.
کونژوگه بدست آمده جهت ارزيابي ايمونولوژيکي طي 2 مرحله با فاصله 14 روز به تعداي خرگوش سفيد نيوزيلندي تزريق گرديد و از هر کدام از خرگوش ها در روزهاي 0،15،30،45 خونگيري از قلب انجام شد.تيتر آنتي بادي توسط سرم باکتريسيدال اسي اندازه گيري شد.تيتر باکتري کشي براي PRP خالص در تزريق اول 16 و در تزريق دوم شاهد افزايش تيتر نبوديم.تيتر باکتري کشي براي کونژوگه در تزريق اول 32 و در تزريق دوم 64 بود که شاهد افزايش تيتر بوديم.با توجه به نتايج حاصل شده ،کونژوگه PRP-ETA سبب تحريک بيشتر سيستم ايمني و افزايش تيتر آنتي بادي در تزريق دوم مي گردد.همچنين اگزوتوکسين A دتوکسيفاي شده يک کرير مناسب مي باشد.
کليد واژه:
هموفيلوس آنفلونزا تيپ b، سودوموناس آئروژينوزا،واکسن کونژوگه، پلي ريبوزيل ريبيتول فسفات (PRP)، اگزوتوکسين A
مقدمه
1-1-1 هموفيلوس آنفولانزا
هموفيلوس آنفولانزا يک باکتري گرم منفي است که اولين بار توسط Pfeiffer در سال 1982 توصيف شد.( پيفر،19822 ) اين که هموفيلوس آنفلوآنزا انگل مخصوص انسان ميباشد باعث شد که اين تصور بوجود بيايد که اين باکتري عامل اصلي آنفلوانزا ميباشد. در هر حال از کالبدشناسي افرادي که مبتلا به حمله ناگهاني (به صورت تکگير) در طي پاندمي آنفلوآنزا در سال 1918 شدهبودند، هموفيلوس آنفلوآنزا ديده نشد.Pittman کشف کرد که سويههايي از اين باکتري ميتوانند در دو گروه کپسول دار (قابل تيپبندي) و بدون کپسول (غير قابل تيپبندي) تقسيم بشوند( پيتمن،31931 ). Pittman بيشتر توانست نشان بدهد که شش تيپ هموفيلوس آنفلوآنزا بوسيله سرولوژي اختصاصي کپسولشان از a-f قابل تيپبندي هستند. به طور عمده سويه تيپ (Hib) b باعث حملات اصلي بيماري از جمله: مننژيت و سپتيسميا و به دنبال آن اپيگلوتيت، سلوليت، آرتريتسپتيک، پنوموني ميشوند(آلکساندر، 41965). سويه بدون کپسول (غير قابل تيپبندي) منجر به: اوتيت مديا، سينوسيت و عفونت حاد دستگاه تنفسي تحتاني ميشود.بيشترين احتمال آلودگي به بيماري مرتبط با هموفيلوس آنفلوآنزا، کودکان بين سنين 10 تا 16 ماه هستند و اخيراً به عامل اصلي ميليونها مرگ در کشورهاي در حال توسعه تبديل شدهاست. در طي اين زمان، کودکان به طور کامل بوسيله سيستم محافظتي آنتيبادي محافظت نميشوند و همچنين در سرمشان آنتيباديهاي توسعه يافته وجود ندارد (فاترگيل و همکاران،51933) جلب توجه بيماريزايي عفونت هموفيلوس آنفلوآنزا با ورود شيمي درماني توسط مواد آنتيميکروبيال کاهش پيدا کرد. با اين وجود مرگ و مير ناشي از مننژيت که بوسيله هموفيلوس آنفلوآنزا در آمريکاي شمالي در سال 1930 ايجاد شد تقريباً در 100% از موارد مبتلا بود(تيلر وهمکاران،19906). با ظهور آنتيبيوتيکها مرگ و مير در اواسط سال 1960 به 10-5% کاهش پيدا کرد(هاگرتي وهمکاران،19647- ترک وهمکاران،19678) به هر حال، در کمتر از 30% از افراد زندهمانده نقص جدي همانند: اختلال در بينايي، شنوايي، حمله ناگهاني بيماري و زوال عقل ديده مي شد.(اسپرولس وهمکاران،19699 ،کروک و همکاران،194910)در طي سال 1970، مقاومت آنتيبيوتيکي سويههاي Hib منجر به تکثير و گسترش آنها شد. در سال 1991 تخمين زده شد که 11% از سويههاي خالص شده هموفيلوس آنفلولآنزا تيپ b نسبت به آمپي سيلين و همچنين بيشتر آنتي بيوتيکهاي معمول که براي درمان آلودگي به اين ارگانيسم استفاده ميشد، مقاومت دارند.(بوي وهمکاران،199111). Jenner و همگارانش مقاومت فوقالعاده و غيرمنتظره سويههاي هموفيلوس آنفلوآنزا را به کلرومنفنيکل در سال 1990 گزارش کردند. (جنر و همکاران،199012) بيماريزايي هموفيلوس آنفلوآنزا فقط تنها موضوع اصلي در مورد اين باکتري نبود، بلکه موضوع ژنتيک بنيادي و تحقيقات مولکولي نيز مطرح بود. در اوايل 1950، هموفيلوس آنفلوآنزا به عنوان دومين نمونه بعد از پنوموکوکوس به عنوان يک ارگانيسم قابل ترنسفورم شدن شناسايي شد. سپس در اواخر 1960، Hamilton smith روي نوترکيبي همولوکوس در هموفيلوس آنفلوآنزا تحقيق کرد، که اين تحقيقات به طور مستقيم منجر به کشف تيپ II آنزيمهاي اندونوکلئازي محدود کننده شد، که اين آنزيم در تکنولوژي DNA نوترکيب بسيار مورد استفاده قرار گرفت. تحقيقات مولکولي و ايمونولوژيکي برروي کپسول پليساکاريدي فوکوس پيدا کرد که بعدها منجر به توسعه و تجارت و انتشار اولين واکسنهاي پليساکاريدي- کونژوگه در سال 1989 شد. در سال 1995 هموفيلوس آنفلوآنزا اولين باکتري آزادزي بود که ژنومش به طور کامل سکانسبندي شد(فليچمن،199513). اين کار بزرگ بسيار قابل توجه بود و باعث شد که سکانسبندي ژنوم بسياري ديگر از باکتريها آغاز شود و استفاده از ژنوم و بيوانفوزماتيک در تحقيقات ميکروبيولوژي شروع شود .
شکل 1-1
کلوني هموفيلوس آنفلوانزا در محيط شکلات آگار
1-1-2 ميکروبيولوژي
هموفيلوس متعلق است به خانواده پاستورولاسه که دو جنس ديگر به نام هاي پاستورولا و اکتينوباسيلوس نيز دارد.اين باکتري متعلق به اين خانواده کوکوباسيل‌هاي غيراسپور کوچک هستند که نيازهاي رشدي مخصوصي دارند و اغلب براي خالص‌سازي به محيط کشت غني شده نياز دارند. اسم جنس، هموفيلوس (به معناي دوستدار خون) وابستگي ويژه‌ي اين ارگانيسم به مولکول‌هاي مربوط به خون براي رشد تحت شرايط هوازي مربوط است. مورفولوژي هموفيلوس آنفولانزا در نمونه‌هاي باليني از کوکوباسيل ها تا رشته‌هاي دراز متغير است. (ديويس و همکاران،197314)

شکل (2-1) هموفيلوس آنفلوانزا
1-1-3 دسته‌بندي سويه هاي هموفيلوس آنفلوآنزا قابل تيپ بندي :
يافته هاي حاصل از اپيدميولوژي بيماري هاي هموفيلوس آنفلوآنزاي تيپ بندي شده منجر به جستجوي مقدماتي براي سيستم نشانگر تبعيضي بين سويه ها شد. در اوايل 1980، ايزوله هاي کلينيکي Hib براساس تفاوت در الگوي تحرک الکتروفورنيک پروتئين هاي خارج غشائي بزرگ(omps) و ليپوپلي ساکاريد(lps) کلاس بندي شدند(بارن کمپ و همکاران،198115، اينزا و همکاران،198416). سويه هاي Hib به يکي از چهار گروه براساس واکنششان با آنتي بادي مونوکلونال اختصاص lps تقسيم شدند.
Musser و همکاران تلاش کردند تا تنوع ژنتيکي و روابط تکاملي بين نژادهاي هموفيولوس را بسنجند. (موسر وهمکاران،199017 و موسرو همکاران 1985). سويه ها بوسيله الکتروفوز آنزيم هاي چندکانوني (MLEE) که در آن چند شکلي آنزيم‌هاي متابوليک ضروري براي برآورد واگرايي از يک نياي مشترک فرضي مورد استفاده قرار مي‌گيرد، دسته بندي شدند. در طول زمان، ژن‌هاي کد کننده آنزيم‌هاي متابوليک ضروري، متحمل جهش‌هاي طبيعي مي‌شوند.. 177 سويهي تيپ b، از خون يا مايع مغزي- نخاعي کودکان آمريکاي شمالي خالص شد و در داخل چندين گروه با تفاوتهاي ژنتيکي يا تيپ هاي الکتروفورزيس قرار گرفت. هر کدام تعدادي آلل هاي همراه غير تصادفي را نشان مي دادند.( موسرو همکاران 1985) سويه هايي که تطابق يا شباهت زياد از نظر ETS داشتند از نواحي مختلف جغرافياي بدست آمدند و اين نتيجه نشان داد که يک خويشاوند کلونال بين سويه هاي تيپ b وجود دارد و نتيجه مهمتر اينکه سويه هايي که باعث بيماري هاي تهاجمي مي شدند از نظر تنوع ژنتيکي داراي محدوديت بودند. بعلاوه اينکه بيشتر ايزولهاي آمريکاي شمالي به دو سويه نزديک از نظر ETS متعلق بودند و متفاوت بودند با سويه هايي که از کشورهاي مختلف اروپايي جمع آوري شده بودند(اروين و همکاران 199518). اين يافته هاي يک آلودگي اپيدميولوژيک را پيشنهاد کرد در حالي که کلونهاي تيپ b موفق شدند از ميان يک جمعيت به ميان جمعيت ميزبان ديگر متمايل شوند و باعث يک هايپراندميک در بيش از يک دوره در سال بشوند و اين تغييرات تقريباً شبيه به تغييراتي بود که در نيسر يا مننژيتيس اتفاق افتاد(جونز و همکاران،199819 و کوگانت،199820). اخيراً کاربرد تکنيک‌هايي مانند مولتي لوکوس سکونس تايپينگ (MLST)، ريبوتايپينگ و توالي‌يابي RNA، تفاوت‌هاي اساسي را بين نژادهاي قابل تيپ بندي و غير قابل تيپ بندي هموفيلوس آنفولانزا آشکار کرده است.
1-1-4 کلون سازي و تهاجم :
بيماري‌زايي هموفيلوس به وسيله‌ي مطالعات موردي و با استفاده از جانوران و مدل‌هاي عفوني invitro بررسي شده است. بررسي هموفيلوس آنفولانزا مثال خوبي براي فهم بيماري‌زايي باکتريايي به صورت کلّي بوده است. چندين مرحله مجزا براي تهاجم هموفيلوس تشخيص داده شده است.
1-2-4 کلون‌سازي در مجراي تنفسي فوقاني
هموفيلوس آنفلوآنزا به طور معمول در سطح مولکولي دستگاه تنفسي انسان و گهگاه در دستگاه ژنيتال زنان مستقر مي شود(گيلسدروف و همکاران،199721). در بچه ها احتمال مستقر شدن باکتري نسبت به افراد بالغ بيشتر است. تقريباً 5% از اشخاص سالم سروتايپهاي a-f را دارا مي باشند (ترک،1994). از نازوفارنکس، ارگانيسم از يک شخص به شخص ديگري بوسيله ي قطرات هوا يا انتقال مستقيم (بوسيله ي ترشحات) انتقال پيدا مي کند.(فارلي و همکاران،199222) واکنش اوليه بين هموفيلوس و انسان در کشت بافت انسان که حد واسطي بود براي اتصال باکتري به ماده بزاقي نشان داده شد(ردي و همکاران،1996 23و ديويس و همکاران،199524). در سيستم هاي کشت در invitro مانند سلولهاي اپي تليال (oropharyhgeal) نشان داده شد که پيلي يک حد واسط براي اتصال مي باشد، پس بنابراين براي جلوگيري از اتصال باکتري به سلول انسان پيلي مورد هدف محققان قرار گرفت (پيچيچيرو و هکگاران،198225- گورينا و همکاران 261982) بعدها گزارش شد که هموفيلوس هايي که فاقد پيلي هستند نيز به ميزان قابل ملاحظه اي توسط پروتئين هاي غشاي خارجي (omps) به سلولهاي پستانداران متصل مي شوند.(جيم و همکاران،199027 و فارلي و همکاران،1990). آنها بوسيله ميکروسکوپ الکتروني (TEN) نشان دادند که هم Hib هايي که داراي پيلي بودند و هم Hib هايي که فاقد پيلي بودند هر دو به طور انتخابي به سلولهاي اپي تليال غير مژه دار متصل مي شوند(فارلي و همکاران،1990). اخيراً گزارش شده که گانگلوزوئيدهاي اختصاصي (ساليتد گليکواسفنگوليپيد) از سلولهاي اپي تليال تنفسي انسان و ماکروفاژهايي که رسپتور براي هموفيلوس آنفلوآنزا دارند سلولهاي مناسبي براي اتصال باکتري مي باشند.(فکيح و همکاران،199728) محققان متوجه شدند که هموفيلوس آنفلوآنزا براي مدت زيادي مي تواند در داخل سلول زنده بماند. اين يافته يک نتيجه گيري مهم را در برداشت، و آن اينکه، معلوم شد که زنده ماندن باکتري در داخل سلول، ريشه کني آنرا به وسيله آنتي ميکروبيالها دچار مشکل مي کند(سادنبرگ و همکاران،198429) مگر اينکه از عواملي که در داخل سلولهاي انساني فعال هستند مانند ريفامپيسن و quinolones استفاده شود. در مطالعات invitro توانايي زنده ماندن هموفيلوس آنفلوآنزا در داخل سلولهاي اپي تليال و ماکروفاژها به اثبات رسيد.(ويليامز و همکاران،199130،نوئل و همکاران،199431)
1-3-4 حمله به اپيتليوم
درسيستم کشت درinvitro، مشخص شد که سويه هاي هموفيلوس آنفلوآنزا يک گرايش شديد به موکوس دارند که اين گرايش منجر به در هم ريختن اتصالات محکم سلولهاي اپي تليال مي شود که نتيجه اين بي نظمي ريزش سلولهاي مژه دار و ciliostasis است(جکسون و همکاران،199632، جانسون و همکاران،198633، فارلي و همکاران،1992). از اين گذشته، آسيب به سلولهاي اپي تليال منجر به در معرض گذاشتن سلولهاي بازال لايه هاي سطحي زيرين و غشاهاي زيرين مي شود. اين روند امکان گسترش عفونت به بافت هاي ديگر را فراهم مي کند.( فارلي و همکاران،1992) نکته جالب توجه اينکه که اين باکتري تمايل زيادي به اين سلولها نسبت به سلولهاي اپي تليال سالم دارد.(هوود و همکاران199034،جيم و همکاران،1990).
1-4-4 حمله به جريان خون
تا اواخر دهه 1970 مشخص نبود که انتقال هموفيلوس آنفولانزا به سيستم عصبي مرکزي (CNS) از طريق گسترش از نازوفارنکس به همراه رشته هاي عصبي حس بويايي اتفاق مي افتد يا طريق مسير خوني. براي بررسي اين مسئله، نژادهابي مشابه هموفيلوس که مقاومت آنتي‌بيوتيکي متفاوت داشتند به داخل بيني موش ها تلقيح شدند يک نژاد در خون و مايع مغزي نخائي (CSF) تشخيص داده شد(ماکسون و همکاران 197835) که نشان دهنده‌ي مسير خوني براي اين ارگانيسم بود. به علاوه، ظهور مننژيت بعد از تلقيح درون بيني، در موش‌هاي صحرايي نشان‌دهنده ارتبط مستقيم با شدت باکتري بود(ماکسون و همکاران 1977).
بررسي‌هاي دقيق ميانکنش مستقيم بين هموفيلوس آنفولانزا و سلول‌هاي اندوتليال با استفاده از مدل سلول‌هاي اندوتليال سياهرگري نافي انساني، انجام شد. با استفاده از TEM، بلع فاگوسيتوزي اين ارگانيسم به وسيله اين سلول‌ها آشکار سازي شد(ويرجي و همکاران،199136). اين مطالعه نشان داد که اين ارگانيسم، بعد از ورود، درون واکوئول‌هاي سلول‌هاي اندوتليال زنده مي‌ماند و سپس به درون تمامي واکوئول‌هاي درون سلول منتقل مي‌شود و در سطح ديگر سلول ظاهر مي‌شود.
همانطور که براي اولين بار Rubin و Moxom گزارش دادند، اکنون پذيرفته شده است که هموفيلوس آنفولانزا از طريق حمله مستقيم به مويرگ‌هاي تغذيه‌کننده‌ي بافت اپيتليال، از بافت زير اپيتليالي به جريان خون گذر مي‌کند.(روبين و همکاران،198337)
1-5-4 بقا در جريان خون
پاسخ ايمني ذاتي و اکتسابي در جريان خون ميزبان بر عليه باکتري به وجود مي آيد و اين در حالي است که باکتري براي به وجود آوردن آلودگي و بيماري بايستي تداوم داشته و زنده بماند.
نشان داده شد که بيش از 90% از جمعيت باکتري هاي تلقيح شده به داخل روده (ir) موش در چند دقيقه از بين رفته اند(ماکسون و همکاران،1981).
جالب اينکه سويه هايي که از سيستم ايمني ذاتي و اکتسابي فرار کرده اند و تداوم داشتند، به ميزان زيادي، به مننژ موش حمله کرده و بيماري مننژيت را ايجاد کرده اند(نوئل و همکاران،1990).
فاکتورهايي که به حيات زير جمعيت ها يا گونه هاي مختلف از هموفيلوس آنفلوآنزا در جريان خون کمک مي کند بعداً به طور کامل مورد بحث قرار مي گيرند.
پاکسازي هموفيلوس آنفلوآنزاي کپسول دار از خون مستلزم نشستن فاکتور c3 روي باکتري مي باشد، که اين عمل مستقل از ترکيبات مکمل بعدي نظير c5- c9 مي باشد. در صورتي که فاکتور c3 برروي باکتري بنشيند، باکتري به دنبال فاگوسيتوز ماکروفاژها از جريان خون خارج مي شود.
کپسول تيپ b از اتصال ابتدائي c3 جلوگيري مي کند و بدين ترتيب هضم باکتري بوسيله ي سلولها فاگويست را کاهش مي دهد(نوئل و همکاران،1990)
کپسول تيپ b به طور آشکارا نسبت به ديگر تيپ هاي کپسول دار اين باکتري در جلوگيري کردن از فاگوسيتوز ماکروفاژها، مؤثرتر عمل کرده و اين توانايي بزرگي بشمار مي آيد و به تيپ b در افزايش ميزان بيماري نسبت به تيپ هاي ديگر برتري مي بخشد.
1-6-4 حمله به CNS
اعتقاد براين است که ميانکنش اصلي بين هموفيلوس آنفلوآنزا و سدخوني- مغزي (BBB) اتفاق مي افتد.
BBB تک لايه اي است که سلولهاي اندوتليال را متمايز مي کند و اينکه مسئوليت اصلي آن نگه داشتن پايداري مواد بيوشيمايي در داخل CNS مي باشد(بتز و همکاران،198638). در سلولهاي اندوتليال اتصالات محکم پيوسته و تعداد کمي مشخصه(علامت) پينوسيتوز وجود دارد(پاتريک و همکاران ،199239). از ميانکنش بين هموفيلوس آنفلوآنزا و BBB در مدل invivo مثل مننژيت در نوزاد موش و همچنين در مدل هاي invivo مثل سلولهاي اندوتليال گاو، توانستند اطلاعات مقدماتي مفيدي بدست آورند(کواگليارلو و همکاران،1986). اين مدلها نشان مي دهد که هموفيلوس آنفلوآنزا به BBB متصل مي شود و سپس از وسط يا بين سلولهاي بافت پوششي به داخل CSF تغيير مکان مي دهد. در Hib, rat زنده يا کشته شده به وسيله گرما پينوسيتوز را افزايش مي دهد و بدين ترتيب اتصالات محکم بين اندوتليال ها را در هم مي ريزد(کواگليارلو و همکاران،198640،ويسپلوي و همکاران،198841). آسيب به BBB و ورود هموفيلوس آنفلوآنزا را به داخل CSF تسهيل مي کند. به يکباره در CSF، جمعيت هموفيلوس آنفلوآنزا ممکن است به طور پيوسته زياد شود و به دنبال آن مننژ مغز را آلوده کند و بيماري مننژيت را سبب شوند.
1-1-5 شاخص‌هاي بيماري زايي هموفيلوس آنفولانزا
به نظر مي‌رسد که هر مرحله از بيماري‌زايي و عفونت‌ هموفيلوس آنفولانزا وابسته به بيان مجموعه‌اي از چندين شاخص بيماري‌زايي است، اين شاخص‌ها عبارتند از: پروتئين‌هاي غشاي خارجي (OMPs)، مژک‌ها، پروتئازهاي IgA1، ليپوپلي‌ساکاريد و کپسول، که تعدادي از اين شاخص‌هاي بيماري‌زايي در موش‌هاي صحرايي و انسان،(بارن کمپ و همکاران،1981، کيمورا و همکاران 198542،گرين و همکاران،199043) سبب ايجاد پاسخ ايمني به هموفيلوس آنفولانزا مي‌شوند و در بين نژادهاي اين ارگانيسم، نسبتاً حفاظت شده‌اند.(نلسون و همکاران،199144،اروين و همکاران،1984) از اين رو آنها به عنوان نامزدهاي واکسن‌ در مقابل بيماري ايجاد شده به وسيله‌ي هموفيلوس بررسي شده‌اند(مونسن و همکاران 198545،کيمورا و همکاران 1985).
1-2-5 OMPs
سويه هاي هموفيلوس آنفلوآنزا بين 10 تا 20، omps در سايزهايي از 16 تا 98 kda (و بيشتر) را بيان مي کند(مرفي و همکاران ،198346). تعداد زيادي از omp ها پروتئين پورين و p2 مي باشند.(لوئب و همکاران،198147،کالتن و همکاران 198348) و از گزارشات جمعي آوري شده اين نتيجه بدست آمده که p2 يکي از عواملي است که در ويرولانس Hib شرکت مي کند. در موتانت هاي ايزوژنتيک از سويه هاي بيماري زاي Hib، اين نتيجه بدست آمده که جلوگيري از سنتزp2 ويرولانس را در نوزادان موش کاهش مي دهد(کپه و همکاران،1990). پروتئين p2 متقابلا با lps عمل مي کند(گوليج و همکاران،198549). پروتئين p5 به هر جهت يکي از عوامل مسئول در تهاجم به اپي تليال موکوس مي باشد و اين اثر به دنبال غير فعال کردن ژنp5، که نتيجه اش کاهش در باکتريها به دنبال تلقيح داخل بيني به نوزادان موش مي باشد، درک شده است(چان يان گام و همکاران،199150) . P6 و 98k omp نشان داده شده که ايمونوژن هستند در انسان و anti- 98k , anti-p6 آنتي بادي هاي محافظت کننده در نوزادان موش در مقابل هموفيلوس آنفلوآنزا است(گرين و همکاران،1990و کيمورا و همکاران 1985).
1-3-5- پيلي
پيلي هموفيلوس آنفلوآنزا 0/18- 7/4 نانومتر قطر و بين 209 و 453 نانومتر طول دارد و همچنين داراي يک مرکز توخالي مي باشد(مانسون و همکاران1985-استول و همکاران،198451). پيلي هموفيلوس آنفلوآنزا بصورت پري ترپکوس مي باشد و مشخص شده که پيلي حد واسط اتصال باکتري به سطح موکوز است و از اينرو باکتري به راحتي در دستگاه تنفسي مستقر مي شود. اندرسون و همکارانش مشاهده کردند که سويه هاي هموفيلوس پيلي دار اتصال قويتري نسبت به واريانتهاي بدون پيلي شان به سلولهاي اپتليال دهان به دنبال تلقيح باکتري دارند.(اندرسون و همکاران،1985). بعدها به دنبال تلقيح هر دو نوع باکتري پيلي دار و غير پيلي دار به وسيله روش ip يا iv به موش نشان داده شده که سويه هاي پيلي دار نسبت به سويه هاي بدون پيلي باکتريماي کمتري را ايجاد مي کنند(گوتيرز و همکاران 199052) و اين به اين دليل است که هموفيلوس هاي پيلي دار تحريک اپسونيزاسيون وابسته به فاگوسيتوزيس بوسيله ي سلولهاي نوترفيل را تسهيل مي کنند(توسي و همکاران ،198553). از گفته هاي بالا به اين نتيجه مي رسيم که بيان پيلي در طي مرحله استقرار بيماري براي باکتري مهم و مفيد است اما در طي مراحل خوني و سيستميک براي باکتري زيان آور است. بيان پيلي در هموفيلوس آنفلوآنزا شبيه ديگر ارگانيسم ها، قابل تغيير است و امکان بوجود آمدن يک پيلي جديد با تفاوت آنتي ژني با پيلي قبلي وجود دارد(کروگفلت،199154). توافق شده که در يک کپي از لوکوس پيلين، ژن hifA و hifE هست و اين لوکوس در تمامي سويه هاي هموفيلوس موردمطالعه به جزء سويه Rd وجود دارد. تمام سکانس ژنومي اين سويه سکونسينگ شده و اينکه سايز آن در حد 1/8Mb است(فليچمن و همکاران،1995) که 0.3Mb کوچکتر از سويه پاتوژن نمونه ي اوليه مي باشد. مشخص شده که ژن hifA باعث کد شدن زير واحدهاي بزرگ پيلي مي شود و ژن hifB، چاپرون پيلوس را کد مي کند(در واقع پوشاننده توالي تکرار دو نوکلئوتيدي مي باشد). مکان اين توالي دو نوکلئوتيدي بين ناحيه ي10- و 35- مي باشد(ون هام و همکاران،199355). در واقع ما در اين توالي، تکرار توالي دو نوکلئوئيدي TA را به وفور مي بينيم و تغيير در اين توالي باعث عدم کفايت اتصال RNA پلي مر از به پروموتور شده و در پي بردن به اينکه سويه هاي داراي پيلي تهاجمي تر مي باشند يا سويه هاي غير پيلي دار با دگرگون کردن توالي تکرار TA ممکن شد.(ملانگا و همکارن،1998 56 ) همانطور که گفته شد تغيير در اين توالي باعث عدم رونويسي مي شود و بدين ترتيب سويه بدون پيلي مي شود و سپس اين امر مسلم شد که سويه هاي غير پيلي دار نسبت به سويه هاي پيلي دار تهاجمي تر مي باشند(فارلي و همکاران،1990).
1-4-5- ايمونوگلوبولين A1 پروتئاز
ايمونوگلوبولين A1 پروتئاز ترکيبي است که به وسيله يک شماري از پاتوژنهاي موکوسي ترشح مي شود. اين پاتوژنها شامل: نيسريا مننژيتيديس، نايسر يا گونه روآ، استرپتوکوکوس پنومونيه و نيز هموفيلوس آنفولانزا است(پولنر و همکاران،198757،پولسن و همکاران،1989 58). IgA1 پروتئاز هموفيلوس آنزيم‌هاي نوع سريني هستند که به صورت پروتئين‌هاي 169 کيلودالتنوني سنتز مي‌شوند (پولنر و همکاران،1987،کلاسور و همکاران ،199359). فعاليت IgA1 پروتئاز تجزيه و غير فعال سازي IgA1، آنتي بادي غالب ترشحي در دستگاه تنفسي فوقاني است(کيليان و همکاران،199660) و باور بر اين است که اين پروتئازها، سبب تسهيل کلونيزه کردن مي‌شوند(پلات و همکاران،198361). IgA1 پروتئازها به طور ويژه يکي از 4 پيوند پپتيدي قرار گرفته درون يک توالي آمينو اسيدي محدود، از ناحيه‌ي لولاي زنجيره‌ي آلفاي IgA1 انساني، شامل فرم ترشحي (S-IgA1) را مي‌شکنند. سپس مولکول‌هاي به صورت قطعات Fab مونومري سالم، از بخش FC جدا مي‌شوند که معمولا مسئول ويژگي‌هاي حفاظتي اين عامل ايمني است(کيليان و همکاران،1988) . در هنگام شکست، دمين C-terminal 50 کيلودالتوني پروتئاز IgA1 در غشاي خارجي باکتري باقي مي‌ماند، در حالي N-terminal داراي فعاليت پروتئوليتيک ترشح مي‌شود. براي هموفيلوس آنفولانزا حداقل دو کلاس پروتئاز IgA1 بر اساس شکست در يوند proly1-sery1 (شناسايي تيپ I) يا چهار آمينواسيد آن طرف‌تر، در پيوند proly1ـthreory1 (نوع 2) تعريف شده است(بريکر و همکاران،198562،گروندي و همکاران،199063). اين پروتئين‌ها، علاوه بر تفاوت در ويژگي شکست، پلي مورفيسم و تنوع آنتي‌ژن قابل توجهي نشان مي‌دهند، به طوري که بيش از 30 نوع از اين پروتئازها، بر اساس پاسخ‌هاي سرولوژيک در انسان، توصيف شده است(لامهالت و همکاران1993،199564).
1-5-5- ليپوپلي ساکاريد (LPS)
ليپوپلي ساکاريد (Lps) ترکيب بزرگي از غشاء خارجي باکتريهاي گرم منفي مي باشد. يک بخش ليپيدي آبگريز(ليپيدA) درحدود 60% از Lps هموفيلوس آنفلوآنزا را تشکيل مي دهد باقيمانده اين مولکول شامل پلي ساکاريد آبدوست مي شود.(زمزه و همکاران 198765). ليپيد A در غشاي خارجي واقع است در حالي که قسمت پلي ساکاريدي بطرف خارج از سطح باکتري گسترش يافته است. برخلاف ساير باکتريهاي روده اي Lps هموفيلوس آنفلوآنزا فاقد o-antigen است و بنابراين شامل يک مجموعه ساده از مونوساکاريدها مي شود(فلشر و همکاران،197866).
1-6-5- نقش LPS در بيماري‌زايي
با وجود غياب آنتي‌ژن O، LPS هموفيلوس آنفولانزا ، نقش مهمي در بيماري زايي ايفا مي‌کند. نژادهاي ايزوژنيک با جهش‌هايي در ژن‌هاي LPS منفرد و از اين رو، ساختارهاي LPS متفاوت ساخته شد و بقا در موش‌هاي صحراي نوزاد مقايسه شد(زوالن و همکاران،1986،198967). همچنين واريانت‌هاي LPS طبيعي، خالص شده به وسيله Mab هاي ويژه‌ي LPS(کيمورا و همکاران،1986،ويزر و همکاران 199868)، به مانند نژادهاي جهش‌يافته‌ي ژنتيکي يا شيميايي(کپه و همکاران،199069 ، هوود و همکاران،1996) با LPS تغيير با نژادهاي والدي، براي بقا مقايسه شد. يافته‌ها تأييد کردند که LPS، به راستي در بيماري‌زايي هموفيلوس آنفولانزا دخيل است.
نقش LPS در ايجاد علائم مننژيت نيز در موش‌هاي صحرايي و خرگوش‌هاي تلقيح شده با LPS؛ به تنهايي و با ارگانيسم کاملي نشان داده شده است(ويسپلوي و همکاران،1988،سيروگيناپلووس و همکاران،198870). به دنبال تلقيح Lps افزايش در قابليت نفوذپذيري در BBB مشاهده شد و يک ارتباط بين pleocytosis (افزايش سلول به تعداد بيش از حد طبيعي در مايع مغزي- نخاعي)، csf و قابليت نفوذپذيري BBB به وجود آمد. نشا داده شد که سميت LPS، عمدتا به خاطر فعاليت بخش A است، زيرا اثرات کشنده‌ي LPS، عمدتا به وسيله‌ي پيش درمان به وسيله‌ي پلي ميکسين B (که به دمين ليپيد A متصل مي‌شود) يا از طريق دآميله کردن LPS (که اسيدهاي چرب غيرهيدروکسيله را از ليپيد A حذف مي‌کند) بازداري شد. از آنجايي که ليپيد A در غشاي خارجي ارگانيسم جاي گرفته است، فعاليت اندوتوکسيک آن اغلب زماني بروز مي‌کند که اين ارگانيسم، ليز شود. براي اينکه LPS بتواند سلول‌هاي ميزبان را به طور قوي فعال کند، بايد به يک پروتئين متصل شود (توبياس و همکاران،198971). کمپلکس Lps-LBPبه CD14 غشا متصل مي شود(m CD14) که به طور عمده روي سلولهاي ميلوئيدي وجود دارد (گويرت و همکاران،198672) و CD14 محلول (scD14) يک فرم ترشحي است که در پلاسما در حال گردش است(هازيوت و همکاران،199373 و کروگر و همکاران،199174). CD14 سپس با Toll- like receptor (TLR)(چو و همکاران 199975،يانگ و همکاران،199876، کريسچينگ و همکاران،199877) واکنش مي دهد و نتيجه اين واکنش به حداکثر رسيدن رهاسازي يک سيگنال سيتوپلاسمي مي باشد(مدژيتو و همکاران،199778، چو و همکاران 1999) بواسطه اين فعاليت کمپلکس آبشاري بواسطه توليد يک سيتوکاين چاشني اتفاق مي افتد.فعاليت سايتوکاينها و ترکيبات مکمل منجر به شوک سپتيک مي شود. ترکيبات خاص از قسمت پلي ساکاريد Lps نشان داده شده که در مراحل مختلف بيماري زايي مهم هستند. براي مثال بيان فسفوکولين در استقرار ارگانيسم در نازفارنکس اهميت دارد(ويسر و همکاران،1998) در حالي که بيان يک دي گالاکتوزيدهاي خاص و اسيد سياليک در طي مراحل عفوني مهم مي باشد و باعث مقاومت برعليه عوامل پاک کننده سيستم ايمني مي شود(چو و همکاران 1999،ويرجي و همکاران،1990،هوود و هککاران،1996). مکان هاي مختلف که سرهم شدن دومين پلي ساکاريدي Lps را فراهم مي کنند بوسيله راههاي ژنتيک شناسايي شده اند. نشان داده شده که چهار تا از اين مکان ها شامل توالي تکراري تترانوکلئوتيدي نزديک به انتهاي مي شود. تصور شده که در طي همانندسازي زنجيرهاي مشابه، جفت شدن اشتباه (mis-paiy) در اين نواحي تکرار شونده منجر به کاهش يا افزايش در يک يا بيشتر اين تکرارها مي شود. بدست آوردن تمامي نواحي ژنوم هموفيلوس آنفلوآنزا (سويه Rd) به ما اجازه شناسايي ديگر تترانوکلئوتيدهاي تکراري ژن Lps همراه با، بالاي بيش از 30 مورد توالي غير تکراري که کانديد هستند به عنوان ژن Lps را مي دهد. به طور مهم تر، فراواني توالي ها، تغييرات در خاموش و روشن شدن و قابليت تغيير مکان به ايجاد تعداد زيايد از چربي هاي گليکوفرم منجر مي شود و مناسب ترين فرم که در مراحل بيماري زايي تواناتر است انتخاب مي شود.
1-1-6 کپسول
کپسول پلي ساکاريدي به طور قابل توجهي اهميتش در بيماري زايي گونه هاي مختلف از باکتري ها مشخص شده است(رابينس و همکاران،1978). هموفيلوس آنفلوآنزا توانايي دارد که يک تا 6 کپسول (a-f) پلي ساکاريدي که از نظر شيميايي و آنتي ژني با هم تفاوت دارند را بيان کند. تيپ a وb پلي ساکاريدشان بدليل اينکه قند پنج کربنه ريبيتول دارند از تيپ هاي c و d و e وf متفاوت است(کريسل و همکاران،197579). کپسول تيپ aشامل پلي مري از glucose-ribitol phosphate است در حالي که تيپ b شامل (PRP)poly- ribose ribitol phosphate مي باشد. تيپ هاي cوf شامل 2-acetamido- 2-deoxyhexose مي باشد که در آنها o-deacylated نيز وجود دارد.( اگان و همکاران،198080) . يپ dوe پلي ساکاريدشان شامل 2-acetamide-2-deoxy- D-mannose uronic acid مي باشد.( توسي و همکاران،198181).
شکل(6-1) تيپ هاي مختلف کپسول هموفيلوس آنفلوآنزا
1-2-6- دخالت کپسول در بيماري‌زايي
يک ارتباط قوي بين توليد کپسول بوسيله هموفيلوس آنفلوآنزا و بيماري تهاجمي در انسان وجود دارد(ترک و همکاران،1967). به طور قابل توجه، گزارش شده که اگر چه هر سروتيپ مي تواند به طور موفقيت آميز در نازوفارنکس مستقر بشود، اما بيشتر از 95% از بيماري هاي سيستميک در انسان توسط سويه هاي تيپ b ايجاد مي شود( ترک و همکاران،1967،والر و همکاران،1977).
در مطالعاتي که در نوزادان موش بعد از تلقيح داخل روده اي (ip) ديده شده نيز ثابت شده که همه سويه هاي کپسول دار توانايي ايجاد عفونت سيستميک را دارا مي باشند اما سويه هاي تيپ b بيشترين ويرولانس را دارا مي باشند.(سويه هاي بدون کپسول غير تهاجمي هستند.) بعلاوه، بعد از تلقيح داخل وريدي(iv) فقط سويه هاي تيپ b باکتريمي پايدار ايجاد کردند. اين تحقيقات مقدماتي بوسيله تغيير شکل دادن ساختمان کپسول همه شش سروتايپ ادامه يافت و نقش omp و Lps نيز شناسايي شد.(زوالن و همکاران،1989) بعد از تلقيح داخل بيني همه سويه ها در نازوفارنکس مستقر شدند، اما باکتريمي ايجاد شده بوسيله تيپ a وb ايجاد شد. بعد از تلقيح (ip) مشخص شد که سويه هاي تيپ b به طور قابل ملاحظه اي بيشتر از هر يک از سويه هايي ترنسفورم شده ديگر ويرولانس دارند.
1-3-6- ژنتيک بيان کپسول
يک کلني منفرد هموفيلوس آنفولانزا فقط مي‌تواند يک سروتيپ کپسولي سنتز کند که تنوع آنتي‌ژن نشان نمي‌دهد با اين حال، کميت کپسول توليد شده مي‌تواند در بين فيلوژني 1، که عمده تيپ هاي ايجادکننده‌ي عفونت تهاجمي هستند، نشان داده شده است(برافي و همکاران،1991 82،کرن و همکاران،199383). توليد کپسول به خوشه‌اي از ژن‌ها در يک لوکوس کروموزومي 18 کيلوبازي که cap ناميده مي‌شود، بستگي دارد. مي‌توان لوکوس cap را به سه ناحيه تقسيم کرد: ناحيه‌ي يک شامل ژن‌ها bex (bexA-D) است که ناحيه‌ي دو شامل 4 ژن دخيل در بيوسنتز پلي‌ساکاريد است. ناحيه 3 شامل دو ORF است به نظر مي رسد که در انتقال پلي ساکاريد به سطح سلول دخيل است. گزارش شده است که در حدود 98% از نژادهاي نوع b، يک حذف از بخشي ازيک کپي از bexA در يک لوکوس Cap دوگانه‌ي ديگر وجود دارد که در مجاورت مستقيم تکرارهاي توالي درج IS 1016 قرار دارد(کورل و همکاران،1991،1993 84). لوکوس Cap نوع b در نژادهاي رده‌ي I، عمدتاً به شکل دوگانه وجود دارد. يکي از اين پلي‌ها داراي يک حذف در bex A است. در نتيجه‌ي دوگانه شدن، يک کپي از Cap به صورت نوترکيبي، از دست مي‌رود و کپي داراي حذف در bexA از دست مي‌رود و بيان کپسول به طور غيرقابل بازگشت، از دست مي‌رود (برافي و همکاران،1991). اين موتانت‌هاي کلاسي I، در طول رشد کشت مايع نمايي با تأخير با فراواني نزديک 20% ايجاد مي‌شوند. جهش‌هاي ثانويه که آثار کشنده‌ي ساخت PRP درون سيتوپلاسم را کاهش مي‌دهند ظهور مي‌کنند. حضور عنصر درج نيز تقويت Copy number لوکوس cap را تا بيش از 5 کپي که در نمونه‌هاي خالص شده باليني مشاهده شده است، تسهيل مي‌کند (کرن و همکاران،1993). کميت بيان کپسول، به صورت وابسته به دوز ژن افزايش مي‌يابد که ممکن است براي بيماري‌زايي سروتيپ نوع b، ضروري باشد. ارگانيسم‌هايي که کپسول بيشتري توليد مي‌کنند ممکن است داراي مزيت انتخابي در مجراي تنفسي باشد. براي مثال، ممکن است کپسول هيدروفيلي يک محافظ فيزيکي در مقابل خشک شدن باشد و مقاومت در مقابل حمله‌ي غيراختصاصي نوتروفيل‌ها و ماکروفاژها را افزايش دهد(روچ و همکاران،199585). ارگانيسم‌هايي که کپسول خود را از دست مي‌دهند، ممکن است در تهاجم به سلول ميزبان داراي مزيت انتخابي باشند(جيم و همکاران،1991،لمپ و همکاران،1982 86). چندين گروه پژوهشي، مدارکي فراهم آورده‌اند که موتانت‌هاي فاقد کپسول، در مورد سلول هاي اندوتليال نيز نشان داده شده است. ويرجي و همکاران ميانکنش‌هاي Hib کپسول‌دار (b+) و بدون کپسول (b-) را با HUVIECS بررسي کردند.(ويرجي و همکاران،1991) حضور کپسول نوع b، سبب کاهش تجميع باکتري‌هاي با سلول‌هاي اندوتليال شد. باکتري‌هاي -b بيشتري در مقايسه با +b وارد HUVIECS شدند.
1-1-8 روشها و آزمونهاي تشخيص آزمايشگاهي:
1-2-8 روشهاي تشخيص کلاسيک:
الف- نمونهها: براي تهيه گستره و کشت، نمونه از



قیمت: تومان


پاسخ دهید